2024-08-12

Broad-Spectrum Antiviral Agents against SARS-CoV-2 Variants Inhibit the Conserved Viral Protein Nsp1–RNA Interaction 

 □ 새로운 SARS-CoV-2의 항바이러스 표적, 비구조 단백질(non-structural protein, Nsp1)

 ○ SARS-CoV-2 변이체의 지속적인 출현은 코로나19 감염병 위협을 지속시킴

   - 특히, 오미크론 하위 계통은 빠른 돌연변이 속도로 몇 달마다 새로운 하위 계통이 발생됨

   - 기존 mRNA 백신 및 최근 BA.5 2가 부스터 mRNA 백신은 오미크론 변이 중화에 한계를 지니며,

   - SARS-CoV-2는 다양한 치료제에 대한 내성으로 재 감염 위험이 높음

 ○ 오미크론과 같이 지속적으로 진화하는 변종을 포함한 다양한 베타 코로나 바이러스에 효과적으로 대응할 수 있는 범용 치료제 개발 필요

   - 모든 SARS-CoV-2 변이체에서 공통적으로 유지되는 영역을 표적하는 치료제 개발 전략

 ○ 바이러스 단백질 중 Nsp1은 바이러스에 의해 가장 먼저 합성된 단백질 중 하나로, sarbecovirus (SARS 연관 코로나바이러스) 유전체 내 보존되어 있으며

   - 9,233,612개 SARS-CoV-2 서열 분석 결과, 86.8%의 변이체가 변하지 않은 Nsp1 서열 유지 (12.7%, 단일 돌연변이)

   - SARS-CoV-2 단백질 중에서 바이러스 복제 및 병원성의 중요한 조절자로 알려짐 

   - 본 Nsp1 단백질 보존성은 다른 바이러스 단백질과 달리 치료 표적이 가능성 제시

 □ Nsp1 번역(translation) 억제 기작 및 SARS-Cov-2 복제 중 역할

 ○ Nsp1은 숙주 단백질 합성을 억제하여 숙주의 면역력 및 항바이러스 방어력을 약화시켜 바이러스 복제를 촉진하고 병원성을 높힘

   - SARS-Cov-2 비감염 중에는 숙주 mRNA는 세포 번역을 위해 40S 리보솜 소단위의 mRNA 진입 채널(entry channel)로 들어가지만,

   - SARS-Cov-2 감염 중에는 Nsp1의 C-말단 도메인(C-terminal domain of Nsp1, Nsp1-CT)이 40S 리보솜 소단위의 mRNA 진입 채널에 직접 결합하여 숙주의 mRNA 번역을 억제함

   - 동시에, N-말단 도메인(Nsp1-NT)은 바이러스의 5'UTR의 stem-loop 1 부분 상호작용으로 바이러스 RNA 번역을 선택적으로 촉진, 숙주 세포의 Nsp1 번역 억제 회피, 효율적으로 바이러스를 복제함

□ Nsp1 억제를 위한 Dual-Luciferase 기반 항바이러스제 스크리닝

 ○ 세포 내 Nsp1 및 SL1 간 상호작용 조사를 위하여 SARS-CoV-2 5'UTR이 포함된 나노루시퍼레이즈(nanoluciferase, NLuc)를 활용한 듀얼-루시퍼레이즈 (Dual-Luciferase) 리포터 분석법 개발

   - Dual-Luciferase 분석법은 세포 시스템 내에서 Nsp1-SL1 상호작용을 고속으로 모니터링 할 수 있음

   - NanoLuc 리포터에 SL1이 포함된 경우, Nsp1 존재 시 높은 신호를 생성하여 바이러스 RNA 번역을 선택적으로 촉진

   - Nsp1 억제제 주입 후에는 리보솜 복합체의 형성을 방해하여 번역 억제 해제하고 낮은 신호를 생성함

 ○ SL1과 Nsp1이 동시에 존재할 때 루시퍼레이즈 신호 증가, SL1이 없는 리포터를 사용할 경우 Nsp1이 루시퍼레이즈 신호를 크게 감소시킴

   - 분석 시스템이 Nsp1과 SL1 간 상호작용을 의존함

   - 루시퍼레이즈 신호는 Nsp1의 농도가 증가함에 따라 더 크게 억제됨

 ○ 464개 화합물 스크리닝 결과, P23E02를 항바이러스제 후보로 선택함

□ P23E02의 Nsp1 결합 기전 및 생화학적 분석

 ○ P23E02와 Nsp1의 결합 확인을 위하여 CETSA (Cellular Thermal Shift Assay) 사용

   - P23E02 존재 시 Nsp1의 열 안정성 감소, P23E02와 Nsp1 상호작용 확인

 ○ DSF (Differential Scanning Fluorimetry)을 통해 P23E02에 의해 Nsp1의 융해 온도(melting temperature, Tm) 감소 확인

   - P23E02는 Nsp1에 결합하여 열적 안정성을 변화시키며, Molecular Docking Analysis를 통해 P23E02가 Nsp1에 선택적으로 결합하는 것을 확인함

□ P23E02에 의한 Nsp1 억제 및 인터페론 매개 항바이러스 반응 회복 기작

 ○ P23E02는 Nsp1에 의해 억제된 RIG-I*, ISG15**의 발현 농도를 의존적으로 회복시키는 것을 확인

   - P23E02 자체는 RIG-I와 ISG15의 발현을 직접적으로 유도하지는 않음

   *바이러스 RNA를 인식하여 인터페론 반응 유도, 숙주 세포 항바이러스 상태로 전환 

   **인터페론에 의해 유도되는 유전자, 항바이러스 도움

 ○ Nsp1의 특정 변이체들이 IFN (인터페론) 매개 항바이러스 반응에 미치는 영향 평가

   - K58A/R119A (58번째 라이신을 알라닌으로 전환/119번째 아르기닌을 알라닌으로 전환) 돌연변이체는 Nsp1 억제 기능을 감소하였으며,

   - 특히 R99A (99번째 아르기닌을 알라닌으로 전환) 돌연변이는 Nsp1의 번역 억제 기능을 대부분 제거함

 ○ 면역침강반응 분석(immunoprecipitation assay)을 통해 P23E02는 Nsp1과 40S 리보솜 소단위 간 상호작용을 방해함으로써, 

   - Nsp1이 숙주의 항바이러스 RNA 번역을 억제하는 기능을을 차단하는 것을 확인함

   - P23E02는 바이러스 RNA 대신 숙주 항바이러스 RNA 번역을 촉진하는 기작을 항바이러스 효과를 발휘함

□ P23E02의 SARS-CoV-2 및 변이체에 대한 항바이러스 활성 및 렘데시비르(remdesivir) 동반 상승 효과

 ○ P23E02는 SARS-CoV-2 및 다양한 변이체에 대해 항바이러스 활성을 나타냈으며, 특히 오미크론 변이체에 대해 가장 높은 효능을 보임

 ○ 렘데시비르 병용 처리시 동반 상승 효과를 보이며, 두 약물을 함께 사용했을 때 SARS-CoV-2 및 범용 SARS-CoV에 대한 치료 효과를 기대함

 ○ P23E02는 다양한 사베코바이러스에 일관된 억제 활성을 유지함

 ○ P23E02는 SARS-CoV-2의 Nsp1 단백질과 결합해 바이러스 번역을 억제함으로써 광범위한 항바이러스 효과를 보여줌

원문 출처 Link